Localización inesperada de silicio en el exoesqueleto de carbonato de calcio de cocolitóforos fósiles y cultivados |Informes Científicos

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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 7417 (2023) Citar este artículo Bloque de aleación FeSi

Localización inesperada de silicio en el exoesqueleto de carbonato de calcio de cocolitóforos fósiles y cultivados |Informes Científicos

Los cocolitóforos, fitoplancton marino calcificante, son importantes productores primarios que impactan el ciclo global del carbono en diferentes escalas de tiempo.Sus estructuras biominerales, los cocolitos que contienen calcita, se encuentran entre las partes duras más elaboradas de cualquier organismo.Comprender la morfogénesis de los cocolitos no solo es relevante en el contexto de la ecofisiología de los cocolitóforos, sino que también informará la investigación sobre biomineralización y diseño de cristales de manera más general.El reciente descubrimiento de un requisito de silicio (Si) para la formación de cristales en algunos cocolitóforos ha abierto una nueva vía de investigación sobre biomineralización.Para desarrollar una comprensión mecanicista del papel del Si, es necesario conocer la presencia y localización de este elemento químico en los cocolitos.Aquí, documentamos por primera vez la distribución desigual de Si en cocolitos de Helicosphaera carteri a través de tres técnicas basadas en sincrotrón que emplean fluorescencia de rayos X y espectromicroscopía infrarroja.El enriquecimiento de Si en áreas específicas de los cocolitos apunta a un papel específico de este elemento en la formación de cocolitos.Nuestros hallazgos marcan un paso clave en la investigación de la biomineralización porque abre la puerta a una comprensión mecanicista detallada del papel que desempeña el Si en la formación de cristales de cocolitos.

LM Otter, K. Eder, … DE Jacob

T. Beuvier, I. Probert, … A. Gibaud

Antonio G. Checa, Elena Macías-Sánchez, … Nelson A. Lagos

Los cocolitóforos son organismos unicelulares marinos que cubren sus células con plaquetas de carbonato de calcio (CaCO3), los cocolitos, formando un exoesqueleto llamado cocosfera (Fig. 1a,b)1,2.Dado que los cocolitóforos desempeñan un papel fundamental en el ciclo global del carbono a través de la bomba de carbono orgánico y la contrabomba de carbonato3,4, comprender su fisiología es fundamental para predecir su distribución y abundancia futuras en los océanos y, por tanto, su papel en la fijación y exportación de carbono. .Hasta hace poco, el estudio de la fisiología de la calcificación de los cocolitóforos se ha centrado principalmente en los componentes estructurales de la calcita de los cocolitos, es decir, el ion calcio (Ca2+) y el carbono inorgánico disuelto1,5,6, y en el fraccionamiento de ciertos elementos menores como el estroncio (Sr)7 ,8,9.Dado que el silicio no es un componente de la calcita, el requerimiento de Si de algunas especies de cocolitóforos no se esperaba y no se cumplió hasta que Durak et al.10 demostraron que algunas especies necesitan Si para calcificarse.Estas especies dependientes de Si expresan transportadores de silicato similares a diatomeas (SITL), lo que enfatiza el papel nutritivo que desempeña el Si10.Considerando la noción contraria a la intuición de una dependencia del Si en el proceso de producción de calcita (cocolitogénesis), no es de ninguna manera evidente por qué algunos cocolitóforos deberían necesitar Si para sobrevivir.Se podría obtener una pista del ejemplo de Coccolithus braarudii, que necesita una cocosfera para la división celular11.Una cocosfera intacta depende de cocolitos formados normalmente12, y la morfogénesis normal de los cocolitos a su vez depende del Si en esta especie11.Más específicamente, se demostró que la morfogénesis de los cristales de heterococolito (HET) es un proceso dependiente del Si, en particular la modificación del crecimiento de los cristales, a diferencia de la nucleación13.Comprender la cristalización y la conformación de los cristales son el núcleo de la investigación sobre biomineralización y biomimética (diseño de cristales).A pesar de esta centralidad de la cristalización y conformación de los cocolitos, estos procesos no se conocen bien14.El requerimiento de Si en algunas especies de cocolitóforos abre una nueva forma de observar el mecanismo de la morfogénesis biomineral.La investigación está en sus inicios y aún faltan datos fundamentales como la presencia y distribución de Si en los cocolitos.

Micrografías de la especie Helicosphaera carteri al microscopio electrónico de barrido (SEM).Micrografías recopiladas del cultivo monoespecífico C1: (a) cocosfera completa (aumento de 10.000 ×), (b) cocolito único (25.000 ×) y (c) detalle de la estructura del elemento calcita de un cocolito (60.000 ×).Imágenes de restos fósiles de H. carteri extraídas de las muestras F1 (d – e) y F2 (f – g): cocolitos individuales (d 30.000 ×; f 20.000 × aumento);Detalles de la disposición de los cristales de calcita (e 55.000 ×; g 60.000 ×).Se informan barras de escala para todas las micrografías.Esquema de la estructura del cocolito de H. carteri y terminología específica rediseñada y modificada de Young et al.22: (h) vistas proximal, (i) sección y (j) distal.Las micrografías de cocolitos detrás de los esquemas provienen de la muestra F2: (h) H. carteri, (j) H. wallichii.

En este estudio, documentamos por primera vez la presencia y localización de Si en cocolitos fósiles y cultivados de la especie Helicosphaera carteri (Fig. 1).Esta especie fue seleccionada porque puede ser dependiente de Si, ya que pertenece al orden de los Zygodiscales que incluye a Scyphosphaera apsteinii, una especie que utiliza SITL10,13.La fisiología de Helicosphaera carteri ha sido poco estudiada hasta ahora, aunque es prolífica tanto en mar abierto como en áreas estuarinas/neríticas15,16,17 y tiene un registro geológico abundante desde que surgió en el Mioceno temprano (ca. 23 Ma)18.También contribuye en gran medida a la producción marina de CaCO3 y al almacenamiento de carbono tanto en sedimentos pasados15,19 como presentes4,20,21.Helicosphaera tiene una morfología única caracterizada por: (i) un reborde espiral que se desarrolla a lo largo del margen elíptico del cocolito, (ii) una manta que forma la cubierta distal, (iii) una placa proximal compuesta de elementos radiales discretos y (iv) dos aberturas centrales22 (Fig. 1h-j).

Para detectar la presencia de trazas de Si dentro de los cocolitos, y también su contenido y distribución, aplicamos tres técnicas no destructivas y de alta resolución basadas en sincrotrón en la instalación de radiación sincrotrón Elettra Sincrotrone Trieste: (i) Fluorescencia de rayos X (XRF) en la línea de luz XRF;(ii) Microscopía de rayos X de transmisión de barrido (STXM) junto con XRF de baja energía (LEXRF) en la línea de luz TwinMic;(iii) Espectromicroscopía infrarroja por transformada de Fourier (μFTIR) en la línea de luz de la fuente infrarroja sincrotrón para espectroscopia e imágenes (SISSI-Bio).Aunque el uso de estas técnicas analíticas avanzadas y complementarias se está empleando cada vez más en los campos de las ciencias biológicas y ambientales, así como en la investigación de la biomineralización de organismos vivos y fósiles23,24,25, han sido poco explotadas para estudios de cocolitóforos.Hasta ahora, sólo unos pocos trabajos que investigan oligoelementos contenidos en cocolitos cultivados y fósiles emplearon fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón26,27,28,29 o espectroscopías moleculares30,31,32.Estos estudios se centraron principalmente en elementos químicos más pesados que el Si, a saber, calcio (Ca), hierro (Fe), zinc (Zn) y Sr, por lo que la presencia de Si no se estudió y solo se mencionó brevemente en un estudio29.Mediante el uso de configuraciones de instrumentos específicas y rangos de energía adecuados en las tres líneas de luz de sincrotrón, documentamos por primera vez no solo la presencia sino también la localización de Si en cocolitos fósiles y cultivados de H. carteri.

Los mapas XRF, adquiridos en una cantidad concentrada de cocolitos cultivados de H. carteri (muestra C1; Fig. 2a), evidenciaron en resolución micrométrica no solo una alta señal de Ca, que es bien conocido por ser uno de los principales componentes de cocolitos33,34,35 (Fig. 2b), pero también la presencia de Si (Fig. 2c).Para las muestras fósiles monoespecíficas (F1 y F2), las mediciones a nivel de cocolito único fueron difíciles debido al tamaño del haz (> 20 µm) de la línea de luz XRF, pero aún así los mapas XRF revelaron la superposición de Si y Ca (Fig. S1).Una vez identificada la presencia de Si en la línea de luz XRF, la señal de Si se investigó más a fondo en una escala de longitud submicrométrica, es decir, a nivel de cocolito único, utilizando la línea de luz TwinMic.El mapeo LEXRF en 13 cocolitos individuales de H. carteri indudablemente confirmó no solo la presencia de Si en todas las muestras, tanto cultivadas (C1) como fósiles (F1 y F2), sino que también reveló su localización en un solo cocolito (Figs. 3, S2).Todos los mapas son bien comparables entre los diferentes tipos de muestras, devolviendo imágenes de absorción (Abs) y contraste de fase diferencial (PhC) similares con señales transmitidas más bajas en la porción interna del cocolito, que también es la parte más gruesa de la morfología de esta especie. donde la placa proximal se superpone con la manta (Fig. 3, S2).La superposición de mapas LEXRF de Si (Si_K) con las correspondientes imágenes de absorción (Abs + Si) permitió resaltar la localización del Si y compararla con la morfología del cocolito.En general, en los cocolitos cultivados, el Si parece estar ubicado a lo largo del reborde y el margen de la placa proximal, así como a lo largo del eje longitudinal que cruza las aberturas centrales (Fig. 3a, S2a).También se observan algunas acumulaciones concentradas de Si en un área específica de los márgenes externos, pero no están necesariamente asociadas con una característica visible en las imágenes de absorción o contraste de fase.Los cocolitos fósiles muestran una distribución de Si menos uniforme o característica en comparación con los cultivados.El silicio parece estar ubicado más como puntos calientes, a veces visibles como áreas más oscuras en las imágenes de absorción, lo que posiblemente esté relacionado con la presencia de pequeños trozos pertenecientes a otros cocolitos fósiles (Fig. 3b, c, S2b, c).En tales áreas, el Si está alcanzando niveles mucho más altos que en los cocolitos cultivados en general, mientras que el área de la placa proximal del fósil H. carteri parece, en promedio, más agotada en Si que el área correspondiente de los cocolitos C1.

Datos recopilados en la línea de luz XRF en cocolitos seleccionados del cultivo monoespecífico de H. carteri (C1).(a) Micrografía adquirida con un microscopio óptico en modo de transmisión con un aumento de 400 ×.Algunos cocolitos están resaltados por círculos amarillos en el área menos densa de la muestra depositada.La barra de escala es de 50 μm.Mapas XRF de (b) líneas Ca Kα y (c) Si Kα (ligeramente suavizadas) recopiladas con un haz incidente de 5 keV, destacando su colocalización;la resolución espacial es igual a 50 × 200 µm2.Las barras de escala son de 2 mm.También se informan barras de escala de colores, con los recuentos normalizados según la intensidad I0 incidente.Los mapas se generaron con el paquete de software PyMCA36 (https://pymca.sourceforge.net/).

Ejemplos de mapas XRF recopilados en TwinMic en cocolitos individuales de H. carteri de la muestra de cultivo monoespecífica C1 (a) y muestras fósiles F1 (b) y F2 (c).Las imágenes de absorción (Abs) y contraste de fase (PhC) de cocolitos se representan junto con el mapa Si XRF correspondiente (Si_K) y la imagen superpuesta de absorción y distribución de Si (Abs + Si).Todas las imágenes se adquirieron a 1,92 keV con un tamaño de paso de 300 nm y un tiempo de adquisición de 60 ms para Abs y PhC, mientras que 15 s para el mapa XRF.La barra de escala es de 2 μm.Las barras de colores informan los recuentos de intensidad.Los mapas se produjeron utilizando el paquete de software PyMCA36 (https://pymca.sourceforge.net/).

Si bien la técnica de fluorescencia de rayos X revela claramente la presencia de Si, no proporciona información sobre el entorno químico que lo rodea.Por otro lado, la espectromicroscopía infrarroja en la línea de luz SISSI-Bio nos permitió identificar picos relacionados con las vibraciones de Si-X, donde X puede ser oxígeno, carbono o nitrógeno.Los mapas devueltos de CO32− atribuibles a la presencia de la forma cristalina de CaCO3 muestran una buena correspondencia con la distribución Si-X, lo que demuestra que ambas señales μFTIR se localizan con los cocolitos (Fig. 4).Un total de 246 espectros μFTIR adquiridos con resolución micrométrica en cocolitos individuales complementan los resultados de las señales de Si obtenidas en TwinMic con resolución nanométrica en un número menor de cocolitos (Tabla 1).La intensidad variable de los mapas de CO32- y Si-X y los espectros μFTIR de cocolitos individuales documentan una alta variabilidad dentro de la misma muestra (ver espectros IR en la Fig. 4).

Ejemplos de micrografías, mapas de CO32- y Si-X recopilados a través de la línea de luz SISSI-Bio en cocolitos individuales de H. carteri aislados de la muestra de cultivo monoespecífica C1 (a) y las muestras fósiles F1 (b) y F2 (c).Algunos de los cocolitos analizados en las líneas de luz SISSI-Bio y TwinMic están resaltados con círculos rojos.La barra de escala es de 50 μm.Los espectros reportados se derivan de los cocolitos llamados #1 y #2 y resaltados por las flechas blancas.En los espectros, la forma cristalina de CaCO3 se puede atribuir a la banda ancha de 1600-1300 cm-1 y al pico a 865 cm-1;mientras que los enlaces químicos del Si con otros elementos son identificables por la banda de 1200 a 950 cm-1 con un pico en 1075 cm-1.Los mapas y espectros se generaron utilizando el software Quasar37 (https://quasar.codes/).

Este estudio muestra por primera vez la peculiar localización del Si en cocolitos fósiles y cultivados de H. carteri.Podemos excluir cualquier contaminación de la señal de Si derivada de cocolitos ya que: (i) los soportes y portamuestras se seleccionaron intencionalmente para que no tuvieran Si (es decir, películas Mylar y rejillas Au TEM con Formvar);(ii) La concentración de Si del agua de mar utilizada para el medio de cultivo fue baja (0,85 μM), aunque no limitante para el crecimiento de cocolitos13 y, además, la muestra de cultivo se limpió a fondo para eliminar completamente el medio antes de los análisis;(iii) El Si se registró tanto en muestras cultivadas como fósiles y, por lo tanto, es poco probable que se derive de algún medio específico (para el cultivo) ni de ningún proceso de depósito/posdeposición (para los fósiles).Para las muestras fósiles, podemos descartar que la señal de Si pueda derivarse de la presencia de sílice coloidal ya que no se registran en el Pacífico Norte a ninguna profundidad de la columna de agua ni en la interfaz agua-sedimento38.

Pudimos detectar claramente Si y describir su localización debido a la diferente instrumentación y configuración en comparación con estudios previos basados en sincrotrón sobre cocolitóforos.De hecho, Bottini et al.26 y Suchéras-Marx et al.28 realizaron mediciones XRF en aire en régimen de rayos X duros utilizando una energía de excitación de 17 keV, lejos del borde K de absorción de Si, perjudicando así la detección de Si. (Tabla 1).La detección de fotones XRF de silicio requiere vacío o una fina capa de aire entre la muestra y el detector.Sólo Suchéras-Marx et al.29 utilizaron una configuración en vacío con una energía incidente más baja (7,5 keV) identificando algunos picos de Si en los espectros de cocolitos fósiles de Coccolithus pelagicus, H. carteri y Calcidiscus leptoporus, aunque no se prestó atención a Si su señal era muy débil (Tabla 1).Aquí, tanto las líneas de luz XRF como TwinMic proporcionaron una excitación óptima para el Si mediante la aplicación de energías más bajas, más cerca del borde K de absorción de Si y también con la ayuda de condiciones de vacío (Tabla 1).Finalmente, la adquisición mediante μFTIR de una señal distintiva de Si-X calculada a partir de los espectros de 246 cocolitos individuales aislados de muestras cultivadas y fósiles, corrobora estadísticamente la presencia de Si dentro de la fracción mineralizada de H. carteri.El gran número de cocolitos individuales analizados en las líneas de luz TwinMic y SISSI-Bio junto con el enfoque estadístico llevado a cabo en SISSI-Bio permitieron resaltar la variabilidad intraespecífica.Esto no pudo evaluarse en otros estudios piloto, donde se analizó un solo cocolito o un número muy pequeño26,28,29 (Tabla 1).Al combinar los datos, pudimos identificar sin ambigüedades la presencia de Si en cocolitos cultivados y fósiles de H. carteri junto con su distribución en los cocolitos desde resolución micrométrica a nanométrica en un gran número de cocolitos nunca antes analizados, especialmente para el registro fósil. (Tabla 1).

El sorprendente descubrimiento de un requerimiento de Si en algunas especies de cocolitóforos ha planteado inmediatamente la cuestión de la función del Si en la biología de los cocolitóforos.El estudio fundamental de Durak et al.10 propuso un papel del Si en la calcificación.Aunque contrario a la intuición, un estudio posterior confirmó esta inferencia, pero dejó abierta la cuestión del papel específico del Si en el proceso de calcificación multifacético11.Más recientemente, se sugirió que el Si desempeña un papel específico en la conformación de los cristales de cocolitos HET13.Por lo tanto, la morfogénesis normal de los cocolitos HET depende del Si en especies que requieren Si, como S. apsteinii.La morfogénesis de los cocolitos en general y el control de la cristalización/forma de los cristales en particular siguen siendo procesos enigmáticos39.Para comprender mejor el mecanismo de la cocolitogénesis, es importante obtener información sobre la presencia y distribución de elementos menores y compuestos orgánicos en los cocolitos14.Si bien la distribución de elementos menores en general es útil, la del Si es particularmente importante porque el Si juega un papel en la morfogénesis en especies que requieren Si, a diferencia de otros elementos menores como el Sr7.Desafortunadamente, se sabe muy poco sobre la presencia de Si en cocolitos, y menos aún sobre su distribución.Los datos presentados aquí muestran claramente que el Si está presente en cocolitos de H. carteri.Aunque no cuantificamos el contenido de Si, encontramos que el Si está por debajo del límite de detección de la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS) (Fig. S3).Esta observación concuerda bien con otras mediciones de EDS40,41 e ICP-MS que muestran que Si/Ca en C. leptoporus, C. braarudii y E. huxleyi está en el rango de µmol/mol41.El bajo contenido de Si de los cocolitos proporciona pistas importantes sobre la función del Si en la morfogénesis.En lugar de ser un componente estructural de la calcita cocolítica, el Si parece desempeñar un papel modificador13.Se desconoce qué componente de la maquinaria morfogenética utiliza Si.Estos componentes son el control de la nucleación a través de una plantilla orgánica y el control del crecimiento de los cristales42.Esto último se logra mediante el crecimiento de cristales inorgánicos, la atracción del citoesqueleto y la interacción de los cristales en crecimiento con polisacáridos asociados a cocolitos (denominados CAP) u otras moléculas orgánicas.Sobre la base de un análisis detallado de las malformaciones de los cocolitos inducidas por Ge, el proceso objetivo de la acción del Si se redujo al control del crecimiento de los cristales13.También existe evidencia morfológica en contra de una interacción Si-citoesqueleto, ya que no se observan malformaciones específicas de Ge en respuesta al tratamiento con inhibidor del citoesqueleto13,43.Por lo tanto, es más plausible un papel del Si en la CAP de la vesícula intracocolito (intra-CV) o en el funcionamiento de las proteínas.En S. apsteinii, un pariente cercano de H. carteri, el requerimiento de Si parece estar confinado a ciertas etapas del crecimiento del lopadolito13.

Si el Si juega un papel específico en ciertas etapas del crecimiento del cocolito, se podría esperar una distribución desigual dentro del cocolito.De hecho, observamos una distribución tan desigual de Si en H. carteri.En promedio, se detecta una mayor concentración de Si a lo largo del margen del reborde y la placa proximal junto con la línea axial central (Fig. 3a).

En este punto es útil comparar la biomineralización de los cocolitóforos con la de los calcificadores extracelulares como los foraminíferos y los moluscos.Estos últimos presentan un crecimiento en capas bien descrito que resulta en una distribución desigual de material orgánico y elementos menores25.La distribución desigual de elementos menores tiene un patrón de bandas característico relacionado con las capas de crecimiento.Este patrón de bandas no indica un papel específico de un elemento menor en la morfogénesis, sino que es principalmente un subproducto accidental de diferentes pasos de fraccionamiento involucrados en la formación de capas de crecimiento.Por el contrario, se cree que la biomineralización de los cocolitóforos se produce mediante un mecanismo fundamentalmente diferente.Después de la nucleación controlada en la placa base, se cree que el crecimiento de los cristales se produce de forma inorgánica modificada por el control de la forma a través del citoesqueleto y el material orgánico intra-CV, principalmente CAP42.No se espera que este mecanismo de crecimiento produzca un patrón de bandas de elementos menores14.En cambio, los modelos actuales de fraccionamiento basados en procesos predicen una distribución uniforme de elementos menores44,45,46.Es posible modificar estos modelos para adaptarse a una distribución desigual, pero requiere más suposiciones7.

La distribución de Si en H. carteri informada aquí se desvía claramente tanto de una distribución uniforme como de un patrón de bandas.Del enriquecimiento de Si observado en ciertas partes del cocolito se pueden extraer dos conclusiones importantes.En primer lugar, el Si no sigue simplemente la ruta de transporte de otros iones, sino que tiene su propio sistema de transporte que permite el enriquecimiento local específico del Si.En segundo lugar, los modelos de fraccionamiento basados en procesos que describen la incorporación de Si deberán incluir este sistema de transporte de Si y encontrar una manera de tener en cuenta la distribución de Si observada.Este transporte de Si dirigido respalda la idea de que el Si desempeña un papel en ciertas etapas del crecimiento de los cocolitos en H. carteri.

Dado que nuestro enfoque resuelve la señal de Si solo en el plano x – y (plano de escudo) del cocolito e integra la señal a lo largo del eje z (perpendicular al plano de escudo), no podemos ubicar Si en el eje z.En consecuencia, no sabemos si el Si está distribuido uniformemente a lo largo del eje z.Por vinculación esto significa que el Si podría residir en la red cristalina o en material orgánico, o en ambos.Estas opciones también están respaldadas por el enlace de Si a C, O o N, como se infiere de nuestros datos infrarrojos.Tenga en cuenta que nuestra interpretación de que el Si juega un papel en ciertas etapas de la formación de cocolitos se basa únicamente en su distribución desigual en el plano del escudo.A nuestra inferencia, la nanolocalización precisa del Si es irrelevante.Sin embargo, sería útil saber si el Si reside en la red de calcita o en material orgánico, porque este conocimiento proporcionaría más pistas sobre el mecanismo preciso de acción del Si en la morfogénesis.Aquí, proporcionamos evidencia que respalda la idea de que el Si juega un papel en la morfogénesis y que este papel podría limitarse a ciertas etapas del crecimiento del cocolito.

El descubrimiento de Si en cocolitos fósiles demuestra que este elemento no se elimina fácilmente con el tiempo y puede identificarse incluso en el registro geológico.En nuestras muestras de fósiles, la distribución espacial es menos regular, mostrando la presencia de puntos de concentración preferenciales (Fig. 3b,c).Esto último podría deberse a la influencia de procesos de fosilización y sedimentación que afectan levemente la preservación de los cocolitos.Más específicamente, como las muestras fósiles F1 y F2 derivan de sedimentos jóvenes (hace 118.000 y 138.000 años respectivamente19) y semiconsolidados perforados en los primeros 1,5 m bajo el fondo marino47, los procesos que actúan sobre los cocolitos pueden estar relacionados principalmente con: (i) bioestratinomía que involucra la desarticulación de los cocolitos de la célula, su dispersión en la columna de agua, la acumulación en los sedimentos y la fosilización;(ii) y prediagénesis principalmente detectable como disolución química de carbonato para las muestras estudiadas.Entre las dos muestras de fósiles, F2 devuelve mapas LEXRF más comparables a C1 que a F1 (Figs. 3b, c; S2b, c).Esta evidencia podría estar relacionada con la disolución de carbonatos que, según se ha documentado previamente, es más fuerte en F1 que en F248 (Fig. 1b-g), aunque la preservación general de los conjuntos fósiles es, en promedio, muy buena19,47,48.

A pesar de la concentración manchada de Si en las muestras fósiles, su distribución es similar a la de los cocolitos cultivados, ya que los puntos calientes se localizan principalmente a lo largo del reborde, los márgenes y el eje central (Fig. 3b, c).Nuestra hipótesis de que el Si puede estar unido a componentes orgánicos sigue siendo plausible ya que los CAP se pueden encontrar en cocolitos fósiles hasta hace 70 Ma49, y la presencia de aminoácidos se ha documentado en cocolitos fosilizados de C. leptoporus de hace 470.000 años50.En el presente estudio, nuestra muestra más antigua data de 138.000 años, por lo que no es lo suficientemente antigua, pero se han planificado mapas Si XRF de cocolitos fosilizados de más de 70 Ma que resultarán útiles aquí para verificar la hipótesis del enlace Si-CAP.Si esto último es correcto, es posible que en H. carteri el Si, y por tanto los CAP, puedan estar más concentrados en el reborde donde muchos cristales componen la porción externa compleja, mientras que el área central constituida por cristales más grandes y menos numerosos22 retiene menos silicio.Respecto al enlace Si-proteínas, hasta la fecha no hay evidencia de la conservación de proteínas o aminoácidos en cocolitos más allá de hace 470.000 años50, a diferencia de otros organismos fósiles biomineralizados51.

Nuestros datos muestran a través de un enfoque innovador de múltiples técnicas el potencial de la fluorescencia de rayos X de sincrotrón y la espectromicroscopía infrarroja para identificar la presencia y localización de Si en cocolitos cultivados y fosilizados.La gran cantidad de cocolitos individuales analizados hace que nuestros resultados sean estadísticamente sólidos de una manera nunca antes lograda en estudios de cocolitóforos.Documentamos por primera vez que el Si se distribuye de manera desigual en los cocolitos de la especie H. carteri, con el margen del reborde, la placa proximal y la línea axial central enriquecidos en Si.Esta distribución se explica mejor por un papel específico del Si en ciertas etapas del crecimiento del cocolito.Nuestros datos no permiten una nanolocalización precisa del Si a lo largo del eje z (perpendicular al plano del escudo), ni podemos inferir si el Si reside en la red de calcita o en el material orgánico que forma parte del cocolito.Los estudios futuros deberían intentar responder a estas preguntas, ya que influyen en el mecanismo molecular preciso de la acción del Si.

Este conocimiento también es fundamental para desarrollar modelos de fraccionamiento de Si.A su vez, es probable que esta comprensión mecanicista avance significativamente en nuestro conocimiento de la biomineralización en general y del diseño de cristales para aplicaciones biomiméticas y tecnológicas.También es necesaria una comprensión mecanicista para evaluar la ecofisiología de los calcificadores marinos y esto eventualmente nos permitirá hacer mejores predicciones sobre su destino bajo el cambio climático.

Los restos fósiles de Helicosphaera carteri analizados aquí provienen de sedimentos marinos de aguas profundas recolectados en el sitio 1209B del Programa de Perforación Oceánica (ODP), perforado a una profundidad de agua de 2387 m en Shatsky Rise, una meseta marina ubicada a 1600 km al este de Japón ( NO del Océano Pacífico).La secuencia sedimentaria consta de exudados nanofósiles, es decir, restos fósiles de cocolitóforos, con algunos otros componentes menores como foraminíferos, diatomeas, radiolarios y arcilla47.De esta secuencia se seleccionaron dos muestras: la muestra F1 fue perforada a 1,1 m bajo el suelo marino (mbsf), depositada durante el último intervalo interglacial denominado Marine Isotope Stage (MIS) 5 y fechada hace 118.000 años19;La muestra F2 se recolectó a 1,4 mbsf de la fase glacial anterior MIS 6 (fechada hace 138.000 años)19.En el Departamento de Biología (Universidad de Pavía), se recogieron individualmente cocolitos individuales de H. carteri del sedimento con un micromanipulador Olympus IX71 siguiendo a Bordiga et al.52.Los cocolitos de gran tamaño de H. carteri hicieron que el proceso de recolección fuera más manejable.Para las mediciones basadas en sincrotrón, se colocaron al menos 100 cocolitos por muestra en una rejilla Au TEM con una capa Formvar para ser analizados en las líneas de luz TwinMic y SISSI-Bio, mientras que se depositaron 100 cocolitos adicionales entre dos capas de película Mylar para su análisis en Línea de luz XRF.La conservación y estructura del cocolito se investigaron mediante la adquisición de micrografías con el microscopio electrónico de barrido (SEM) Tescan Mira 3XMU en el laboratorio CISRic “Arvedi” del Departamento de Ciencias de la Tierra y el Medio Ambiente (Universidad de Pavía).

Se cultivaron cultivos monoclonales de la especie Helicosphaera carteri (cepa RCC1323 de la Colección de Cultivos de Roscoff) en el medio B (cosmi.ogs.it/node/7) obtenido del agua de mar natural recolectada en el Golfo de Trieste (norte del Mar Adriático, Italia). ) después de la filtración a través de filtros de membrana Durapore (Millipore) con un tamaño de poro de 0,22 μm, esterilización en autoclave y suplemento de nutrientes (nitrato y fosfato), metales y vitaminas.El contenido natural de silicio en el agua de mar recolectada fue de 0,825 μmol L-1 [M.Kralj, comunicación personal], cercano al valor < 1,6 μmol L-1 medido en una estación cercana al sitio ODP 120953. Los experimentos se realizaron en fotobiorreactores de 2,5 L (Kbiotech) controlados por el software BioFlex en el Instituto Nacional de Oceanografía. y Geofísica Aplicada (OGS) en Trieste.Las condiciones ambientales documentadas para MIS 554,55 se reprodujeron durante el experimento manteniendo estables los siguientes parámetros: CO2 290 ppm, temperatura 19 °C, salinidad 35 PSU, irradiancia de luz 100 µmol m-2 s-1 y ciclo de luz/oscuridad. de 12:12 h imitando el régimen latitudinal día/noche del Sitio subtropical 1209 estudiado aquí en el registro fósil.Un impulsor de palas inclinadas garantizaba la agitación cultural.La cepa se aclimató a las condiciones experimentales durante dos semanas antes de la inoculación.Por relevancia estadística, se llevaron a cabo tres réplicas cultivadas de forma independiente.Como lo sugieren La Roche et al.56, se tomaron muestras de cocosferas durante la fase exponencial, pero aún con baja densidad celular (≤ 10.000 células ml-1) para evitar un cambio significativo en el carbono inorgánico disuelto (DIC) en el medio y un fuerte cambio. del pH del medio.Los cocolitos se separaron de las células añadiendo una solución de MilliQ tamponada y Triton al 1%.Para la limpieza final de la muestra se realizaron tres enjuagues con MilliQ tamponado con amoniaco (10%, pH ≥ 10) para evitar la disolución.Para los análisis en las instalaciones del sincrotrón, se colocó una alícuota de suspensión de cocolitos sobre una rejilla Au TEM con una capa de Formvar, mientras que otra alícuota más densa se depositó entre dos películas de Mylar.Todas las muestras derivadas del experimento de cultivo están etiquetadas como C1.Las micrografías de cocosfera y cocolitos se recolectaron mediante SEM Tescan Mira 3XMU en el Laboratorio CISRic "Arvedi" del Departamento de Ciencias de la Tierra y el Medio Ambiente (Universidad de Pavía, Italia).El SEM también estaba equipado con el detector EDAX EDS para realizar análisis mediante espectroscopia de dispersión de energía (EDS) en un cocolito de C1 para detectar el silicio.Las mediciones de EDS se procesaron con el software EDAX Spectrum Viewer (https://www.edax.com/support/spectrum-viewer).

La fluorescencia de rayos X es una técnica de elementos múltiples que devuelve la distribución espacial de elementos químicos.En este estudio, se investigaron cocolitos fósiles y cultivados en la línea de luz XRF de Elettra Sincrotrone Trieste (Italia)57.Específicamente, la línea de luz XRF cubre el rango de energía de 2 a 14 keV, lo que permite la detección de líneas K de fluorescencia de elementos desde Na a Br (y líneas L hasta Po) con una resolución espacial lateral> 20 µm (Tabla 1).Para los análisis en la línea de luz XRF, tanto las muestras fósiles como las de cultivo se depositaron entre dos capas de película Mylar, se sellaron con un anillo entrelazado de Delrin y se fijaron en un soporte de muestra de Al exclusivo.Las películas Mylar están compuestas de tereftalato de polietileno, por lo que no contienen silicio.Las mediciones se realizaron utilizando el monocromador multicapa de energía media (ME) para la recolección de mapas con resolución micrométrica con una energía del haz incidente de 5 keV (Tabla 1).Se seleccionó un tamaño de haz variable en las rendijas de salida dependiendo del área de la muestra, desde 200 × 200 µm2 hasta 20 × 20 µm2, y con una geometría estándar de 45°/45° para mediciones en modo de fluorescencia, utilizando un detector de deriva de silicio XFlash 5030 ( SDD) (Bruker, Berlín, Alemania).La contaminación por armónicos de orden superior se suprimió mediante un par de espejos planos paralelos que interceptaban el haz en incidencia rasante.Todos los espectros XRF se procesaron con el paquete de software PYMCA36 (https://pymca.sourceforge.net/).

Los análisis MicroXRF se realizaron en la línea de luz TwinMic en Elettra Sincrotrone Trieste (Italia)58, que funciona en el rango de energía de 0,4 a 2,2 keV (Tabla 1).Tanto las muestras fósiles como las de cultivo se depositaron en rejillas Au TEM cubiertas con una película Formvar, que tiene una tolerancia a la radiación excepcional y no contiene silicio.Se recolectaron un total de 13 mapas XRF de baja energía (LEXRF) de cocolitos individuales de H. carteri (5 para C1, 4 para F1 y 4 para F2) durante aproximadamente 100 h de análisis (aproximadamente 8 h por cocolito).Los 13 cocolitos seleccionados son un subconjunto de los cocolitos analizados mediante espectromicroscopía infrarroja en la línea de luz SISSI-Bio, lo que permite una comparación directa de los mismos cocolitos.Para evitar cualquier posible daño por radiación debido a los rayos X suaves, los cocolitos se midieron primero en la línea de luz SISSI-Bio, ya que la espectromicroscopía infrarroja (IR) no es dañina y no tiene etiquetas.Aplicando estas dos técnicas analíticas podemos proporcionar información complementaria que nos permita obtener una visión más completa de la química del espécimen.En los presentes experimentos, el microscopio TwinMic se operó en modo de transmisión de barrido con una energía del haz incidente de 1,92 keV para obtener una excitación óptima del silicio.Una óptica difractiva de placa de zona de Au de 600 µm de diámetro con una zona exterior de 50 nm de espesor produjo un haz de 350 nm de diámetro que incide perpendicularmente en el plano de la muestra.Los cocolitos se escanearon en forma de trama a través de la microsonda con un tamaño de paso de 300 nm.Para cada píxel en el escaneo rasterizado, una cámara CCD de lectura rápida recolectó los fotones de rayos X transmitidos generando imágenes de absorción y contraste de fase, delineando la morfología del cocolito;simultáneamente, 8 SDD, ubicados a 20 ° del plano de la muestra y a 28 mm de la muestra, adquirieron los fotones XRF emitidos por la muestra, produciendo mapas elementales XRF con resolución espacial nanométrica.Todos los espectros XRF se procesaron y se equiparon por lotes con el paquete de software PYMCA36 (https://pymca.sourceforge.net/).

Las mismas muestras C1, F1 y F2 depositadas en rejillas Au TEM se midieron en la línea de luz de la Fuente Infrarroja Sincrotrón para Espectroscopía e Imágenes (SISSI-Bio) en Elettra Sincrotrone Trieste (Italia)59, antes de ser expuestas a rayos X suaves en TwinMic. línea de luz.Si ambas líneas de rayos X proporcionan una caracterización química a nivel elemental, el análisis en SISSI-Bio arroja datos de espectromicroscopía infrarroja por transformada de Fourier (μFTIR) que pueden brindar información a nivel molecular, identificando los restos químicos presentes dentro de la muestra.Los fotones en el rango del infrarrojo medio (4000–400 cm−1, 0,496–0,0496 eV) tienen energías que corresponden a las de los enlaces covalentes comunes presentes en muestras orgánicas, como C – O, N – O, C – H, N. –H, P–O, C–N, pero también a los de algunos enlaces covalentes inorgánicos como Al–O, Si–O, Fe–O, Si–N, Si–H.Comúnmente, la espectroscopia FTIR es una técnica masiva que proporciona información química promedio en áreas grandes, pero gracias al brillo de la radiación sincrotrón, es posible enfocar el haz infrarrojo (IR) en el límite de difracción, es decir, unos pocos micrómetros para el infrarrojo medio. (MidIR) y para recolectar espectros de cocolitos individuales.Además, al ser una técnica de banda ancha, se puede registrar todo el rango al mismo tiempo, para cada punto.Al pasar de la espectromicroscopía a las imágenes IR mediante transformada de Fourier, fue posible adquirir imágenes infrarrojas hiperespectrales de la distribución de especies químicas específicas dentro de la muestra inspeccionada.Al combinar los datos adquiridos con las dos modalidades es posible: (i) identificar las bandas de interés con el enfoque espectroscópico de cada cocolito, y (ii) obtener imágenes de la distribución química dentro de los cocolitos integrando esas señales.Los espectros de cocolitos individuales se recolectaron utilizando el microscopio VIS-IR Hyperion 3000 (Bruker Optics, Billerica, Ma, EE. UU.) junto con un interferómetro al vacío VERTEX 70 V (Bruker Optics, Billerica, Ma, EE. UU.), utilizando emisión IR sincrotrón ( SRIR) como fuente y un detector MCT (Mercurio-Cadmio-Teluuro) de 100 µm y con un promedio de 512 escaneos a una resolución espectral de 4 cm-1 en modo de transmisión, es decir, la luz atravesará todo el espesor de la muestra y luego será leída por el detector.Se utilizó un par de condensador-objetivo Cassegrain de 15X y las aberturas de visión se establecieron en 10 × 10 µm para recolectar la señal de los individuos.También se tomaron imágenes de las muestras utilizando un detector de matriz bidimensional de 64 × 64 (FPA, Focal Plane Array) a través de la misma óptica (15X, también en modo de transmisión), por lo tanto, con un tamaño de píxel de 2,62 µm en un área de 167 × 167 µm.Los datos se corrigieron para el vapor de agua usando OPUS 8.5 SP1 (Bruker Optics, Billerica, Ma, EE. UU.) y luego se analizaron usando el software QUASAR37 (https://quasar.codes)57.Las integrales de banda se calcularon en el rango de carbonato de calcio (1800-1700 cm-1 y 1600-1300 cm-1) y silicato/fosfatos (1200-1000 cm-1).Se utilizaron los mismos rangos espectrales para generar mapas espectrales.Los mapas de distribución química de CO32- se generaron integrando la banda ancha de 1600-1300 cm-1 y el pico en 865 cm-1, que se pueden atribuir a la presencia de la forma cristalina de CaCO360.Los mapas representativos de los enlaces químicos del Si con otros elementos se derivan de la integración de una segunda banda de 1200 a 950 cm−1 con un pico en 1075 cm−1, que puede tener múltiples atribuciones: desde vibraciones C–O–C desde carbohidratos30, a vibraciones de fosfatos32, a vibraciones de silicatos60 y algunos incluso a carbonato de estroncio61.Esta dificultad de atribución puede superarse con el apoyo de las otras dos técnicas XRF.Se analizaron un total de 246 cocolitos: 97 para la muestra C1, 50 para F1 y 99 para F2.Esta cantidad de datos espectrales infrarrojos de cocolitos individuales nunca antes se había logrado, especialmente en muestras fósiles (Tabla 1).

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones de este trabajo están presentes en el artículo y/o en la información complementaria.

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Esta investigación fue financiada a través de MUR para ECORD-IODP Italia 2018 para MB dentro del proyecto “Geoquímica y biología marina unidas para refinar modelos climáticos”.Los autores agradecen a Elettra Sincrotrone Trieste por la asignación del tiempo de haz: experimento número 20210072 en la línea de luz XRF, n.° 20210070 en la línea de luz TwinMic y n.° 20210071 en la línea de luz SISSI-Bio.GL reconoce la financiación del Ministerio de Universidades de España a través de una beca María Zambrano.Un agradecimiento especial también a Luka Šupraha por sus consejos sobre el cultivo de Helicosphaera carteri, y a Stefania Bianco por dibujar los esquemas de H. carteri.

Instituto Nacional de Oceanografía y Geofísica Aplicada-OGS, Via Auguste Piccard 54, 34151, Trieste, Italia

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ICTA, Universidad Autónoma de Barcelona (UAB), 08193, Bellaterra, España

Elettra-Sincrotrone Trieste, Strada Statale 14, km 163.5 en Area Science Park, 34049, Trieste-Basovizza, Italia

A. Gianoncelli, G. Birarda, S. Pollastri, V. Bonanni, D. E. Bedolla, L. Vaccari & G. Gariani

AREA Parque Científico, Padriciano 99, 34149, Trieste, Italia

Departamento de Biología y Biotecnologías “Lazzaro Spallanzani”, Universidad de Pavía, Via Ferrata 9, 27100, Pavía, Italia

M. Zuccotti, G. Fiorentino, M. Zanoni y S. Garagna

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MB y CL concibieron el estudio, seleccionaron la muestra y escribieron el primer borrador;MB realizó el experimento y la preparación de la muestra;GL contribuyó a la discusión de los datos y la interpretación final;AG, VB y GG realizaron mediciones de fluorescencia de rayos X en la línea de luz TwinMic;GB, DEB y LV realizaron los análisis de IR en la línea de luz SISSI-Bio;SP realizó las mediciones de fluorescencia de rayos X en la línea de luz XRF;FC, MC y AB contribuyeron al plan experimental;M.Zanoni realizó el aislamiento de cocolitos;FC, M.Zuccotti, GF y SG contribuyeron a la discusión de los datos;MC y A.DG.proporcionó una revisión crítica.Todos los autores contribuyeron al borrador final.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Bordiga, M., Lupi, C., Langer, G. et al.Localización inesperada de silicio en el exoesqueleto de carbonato de calcio de cocolitóforos fósiles y cultivados.Informe científico 13, 7417 (2023).https://doi.org/10.1038/s41598-023-34003-3

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34003-3

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Informes científicos (Representante científico) ISSN 2045-2322 (en línea)

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